Classification et identification des virus influenza porcins : suivez le guide

1 COMMENT S’Y RETROUVER DANS LA CLASSIFICATION ET LA NOMENCLATURE DES VIRUS INFLUENZA PORCINS ?

Les virus sont classifiés dans des familles virales définies selon la nature (ADN ou ARN), la structure (monocaténaire ou bicaténaire) et la forme (linéaire, circulaire, segmenté ou non) de l’acide nucléique de leur génome. Des données morphologiques (présence ou absence d’enveloppe, symétrie de la capside) peuvent également être prises en compte. Au sein des familles, des genres viraux sont distingués : ils regroupent des espèces virales qui ont en commun plusieurs caractères similaires. Des sérogroupes (anciennement sérotypes) sont également définis pour affiner la classification et différencier des virus au sein d’un genre.

Ainsi, les virus responsables de la grippe appartiennent à la famille des Orthomyxoviridae, qui regroupe des virus enveloppés, à capsides tubulaires de symétrie hélicoïdale et à ARN simple brin de polarité négative, segmenté. Cette famille comprend cinq genres viraux, dont trois permettent de distinguer les virus grippaux selon les propriétés antigéniques de la nucléoprotéine (NP). Ce sont les genres influenzavirus A, influenzavirus B et influenzavirus C, communément appelés “virus influenza de type A”, “virus influenza de type B” et “virus influenza de type C” en raison d’une ancienne nomenclature qui distinguait des types viraux au sein d’un genre unique, influenzavirus.

Les virus influenza isolés chez le porc appartiennent exclusivement au genre influenza-virus A. Parmi ces derniers, plusieurs sous-types sont distingués selon les caractéristiques antigéniques des deux glycoprotéines de surface, l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). A ce jour, seize hémagglutinines (H1 à H16) et neuf neuraminidases (N1 à N9) sont identifiées.

La nomenclature des virus grippaux permet d’indiquer successivement le type viral (A, B ou C), l’hôte d’origine quand celui-ci est une espèce animale (l’hôte n’est pas indiqué lorsqu’il s’agit de l’homme), le lieu d’isolement (pays, région, département, Etat, etc.), le numéro de la souche virale (propre au laboratoire qui a réalisé son isolement) et l’année d’isolement. Le sous-type viral est parfois précisé. Cela donne, par exemple, la souche ou l’isolat A/Swine/Côtes-d’Armor/0231/06 (H1N1).

2 QUELLES SONT LES TECHNIQUES D’IDENTIFICATION DE CES VIRUS ?

Les virus influenza porcins sont détectés dans les surnageants d’écouvillons nasaux, les lavages broncho-alvéolaires ou les fragments de poumons des porcs infectés. Le diagnostic de première intention est réalisé par reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) en temps réel, “gène M” ou “gène NP”, qui permet l’amplification de séquences nucléotidiques conservées dans le genre influenzavirus A. En France, deux kits commerciaux prêts à l’emploi ont été validés en 2009 par le Laboratoire national de référence (LNR) pour la détection de tous les virus influenza A chez le porc.

Lorsqu’un virus influenza A est détecté, il convient de l’isoler afin de le caractériser, tant au plan moléculaire qu’au niveau antigénique. Le virus est amplifié sur une culture de cellules MDCK (pour madin-darby canine kidney, cellules épithéliales de rein de chien) ou sur des œufs embryonnés de poule. Selon le support d’isolement, la présence du virus est respectivement mise en évidence par un effet cytopathogène (ECP) ou par un effet hémagglutinant (test HA positif).

Le sous-type du virus isolé est déterminé à l’aide de RT-PCR, conventionnelle ou en temps réel, destinée à l’amplification de séquences nucléotidiques spécifiques des HA et NA de lignages viraux donnés. Le LNR met ainsi en œuvre deux RT-PCR multiplex (H1/H3 et N1/N2, respectivement) développées pour l’identification des lignages H1N1, H3N2 et H1N2 en circulation en Europe.

Des RT-PCR en temps réel, spécifiques des gènes H1 et N1 du virus pandémique A/H1N1 (2009) sont également développées pour l’identification de ce virus chez le porc. Trois kits commerciaux, validés par le LNR, peuvent d’ailleurs être mis en œuvre sur les prélèvements biologiques de porc pour une discrimination rapide de ce virus parmi les influenzavirus A.

Au sous-typage moléculaire est associé un sous-typage antigénique, réalisé via des tests d’inhibition de l’hémagglutination (IHA) à l’aide d’un panel de sérums hyperimmuns de référence, représentatifs des différents sous-types ou lignages viraux en circulation chez le porc en Europe ou dans la région investiguée. Ces tests IHA permettent de caractériser la HA d’un virus inconnu sur la base des réactions antigène-anticorps. Des tests d’inhibition de la neuraminidase (INA), également effectués grâce à un panel de sérums de référence, fournissent des indications sur la nature antigénique de la NA, mais, difficiles à mettre en œuvre, ils sont rarement utilisés.

Enfin, la caractérisation des nouveaux isolats peut être affinée et complétée par un séquençage, total ou partiel selon le cas, des gènes HA et NA, voire de tous les segments génomiques.

Les infections grippales sont aussi mises en évidence indirectement, par la détection d’anticorps dans les sérums des animaux. Des tests Elisa, destinés à déceler les anticorps antinucléoprotéine, permettent d’indiquer le statut (positif/négatif) des animaux, à une date donnée, vis-à-vis d’une infection antérieure à virus influenza A. Les anticorps antihémagglutinine sont détectables par des tests IHA, réalisés cette fois à l’aide d’un panel d’antigènes de référence représentatifs des différents sous-types (ou de lignages) viraux en circulation dans la région investiguée.

3 QUELLES SONT LES LIMITES DE CES TECHNIQUES DE DÉTECTION ?

Les nouvelles méthodes de RT-PCR en temps réel, voire de séquençage, sont très sensibles et permettent l’amplification de gènes, donc l’identification de virus, directement à partir des prélèvements biologiques. Cependant, elles ne sont pas disponibles pour tous les lignages viraux et l’identification correcte et complète d’un virus influenza responsable d’un syndrome grippal chez le porc n’est donc possible que si ce virus est isolé et amplifié en culture.

Il convient de réaliser les sous-typages moléculaire et antigénique en parallèle, voire de séquencer les segments génomiques, afin de mettre en évidence d’éventuels virus H1N1 ou H1N2 ayant subi des réassortiments, notamment au niveau du gène HA. En effet, un virus H1N1 qui a acquis le gène HA d’origine humaine des virus H1N2, bien qu’identifié comme un virus H1N1 au niveau moléculaire, réagira avec un sérum anti-H1N2 dans les tests IHA. Inversement, un virus H1N2 ayant acquis la HA d’origine aviaire des virus H1N1 enzootiques, réagira préférentiellement avec un sérum anti-H1N1 bien qu’étant identifié H1N2. En tout état de cause, le diagnostic virologique est à privilégier par rapport au diagnostic sérologique. En effet, le diagnostic sérologique d’une infection par les tests IHA requiert d’utiliser un panel d’antigènes approprié au regard des souches en circulation dans la région investiguée. Par ailleurs, il n’est correctement interprétable que lorsqu’il est effectué sur une paire de sérums, prélevés à trois semaines d’intervalle, la première prise de sang étant réalisée au moment du syndrome grippal. La séroconversion qui suit l’infection sera déclarée effective si une augmentation des titres IHA d’un facteur 4 entre les deux sérums testés est observée. Cependant, l’identification de la souche incriminée, sur la base des résultats de la sérologie par les tests IHA multivalences, n’est pas toujours aisée en raison des réactions antigéniques croisées qui peuvent exister entre différents lignages viraux. De plus, ces tests donnent uniquement une indication sur la nature des anticorps anti-HA produits en réponse à l’infection, mais ne peuvent aboutir à l’identification, avec certitude, du sous-type de la souche, puisqu’un biais est introduit dans le cas d’infections par des virus réassortants tels que ceux décrits plus haut.