La numération-formule sanguine chez les oiseaux

L’hémogramme aviaire est généralement déterminé par des méthodes de comptage manuel et la formule leucocytaire est obtenue par l’évaluation microscopique des frottis sanguins. Il n’existe pas de technique standard automatisée et validée pour la numération-formule sanguine des oiseaux. Cette limitation vient du fait que toutes les cellules sanguines, y compris les érythrocytes et les thrombocytes, sont nucléées, ce qui empêche l’utilisation d’analyseurs programmés pour les mammifères.

De plus, il n’y a pas, à ce jour, de panel d’anticorps aviaires permettant la différenciation cellulaire par immunophénotypage pour les principales espèces d’oiseaux vues en clinique. Ainsi, les techniques de comptage manuel des cellules sanguines sont incontournables pour obtenir une numération-formule sanguine chez un oiseau. Plusieurs méthodes peuvent être employées par le vétérinaire praticien.

PRÉLÈVEMENT

Le sang doit préférentiellement être collecté sur un tube EDTA, hormis pour les espèces dont les cellules sanguines hémolysent avec cet anticoagulant (autruches, certains corvidés, gruidés et bucérotidés notamment). L’héparine peut entraîner une altération de la coloration des cellules et des agrégats thrombocytaires seront présents sur le frottis.

Il convient de faire un ou plusieurs frottis sanguins dès que possible. Chez certaines espèces comme les perroquets, les cellules se lysent aisément lors de la préparation des frottis. Le mélange de 5 gouttes de sang avec une goutte d’albumine bovine à 22 % réduit les artefacts. Alternativement, le frottis peut être préparé de la même manière qu’une cytologie pour minimiser la lyse cellulaire, en mettant 1 goutte de sang entre 2 lames perpen­diculaires et en les faisant glisser lentement pour étaler les cellules. Il est ensuite coloré en utilisant des méthodes standard. Les colorants hématologiques rapides sont à éviter dans la mesure du possible, car la qualité de la coloration est moindre et le différentiel cellulaire plus compliqué à réaliser. Les colorations Wright-Giemsa modifiées sont les principales à utiliser.

LIGNÉE ROUGE

Particularités des oiseaux

Les érythrocytes aviaires sont nucléés, elliptiques, plus volumineux que ceux des mammifères et ont une durée de vie environ 3 fois inférieure (1 mois). Leur morphologie doit être évaluée sur le frottis sanguin. Les polychromatophiles sont les érythrocytes immatures et correspondent approximativement aux réticulocytes. Ils sont plus basophiles, avec un noyau moins condensé.

Hématocrite

L’hématocrite est obtenu par la centrifugation dans des tubes capillaires. La concentration sanguine en hémoglobine peut être déterminée de plusieurs façons : par la méthode “cyanméthémoglobine” ou avec l’HemoCue AB(r) (hémoglobinomètre qui estime l’azide-méthémoglobine par spectrophotométrie et fonctionne chez les oiseaux).

Comptage des érythrocytes

Puisque les érythrocytes sont les principales cellules sanguines, le comptage automatique par impédance électrique est possible, mais sera un peu augmenté par l’incorporation des leucocytes et des thrombocytes (moins de 0,1 % des cellules sanguines).

Pour le comptage manuel, 2 techniques sont principalement utilisées : la méthode Natt et Herrick et la méthode Unopette(r) rouge. Elles consistent en une dilution au 200^e. Pour l’Unopette(r), le sang est dilué en utilisant des pipettes jetables spécifiques contenant une chambre de mixage. Pour l’autre méthode, la dilution s’effectue avec des pipettes classiques en mélangeant 10 µl de sang à 2 ml de solution et les cellules sont colorées en violet par la solution de Natt et Herrick. Après 5 minutes de coloration, un faible volume de mélange est pipeté et placé dans une chambre de comptage de Neubaeur (hémocytomètre). Après un temps d’attente de 5 minutes pour que les cellules se stabilisent, les éry­throcytes sont comptés dans 5 carrés d’une chambre de l’hémocytomètre : au centre et dans les coins (^{voir photo 1}). Pour ne pas compter 2 fois la même cellule, la “technique du L” consiste à ne pas inclure les cellules qui touchent la ligne du haut et de droite. Le nombre obtenu est ensuite multiplié par 10 000 pour connaître le nombre d’érythrocytes par millimètre cube.

Indices érythrocytaires

Le volume globulaire moyen (VGM), la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH) et le taux corpusculaire moyen en hémoglobine (TCMH) peuvent ensuite être obtenus en utilisant l’hématocrite et la concentration en hémoglobine.

LIGNÉE BLANCHE

Le comptage leucocytaire peut être réalisé de plusieurs façons, mais exige souvent une identification et une différenciation adéquates des types leucocytaires. 3 méthodes, relativement rapides, sont communément employées.

→ D’après le frottis

La méthode sans doute la plus rapide et économique consiste à évaluer le nombre de leucocytes directement d’après un frottis sanguin. À l’objectif x 10, les cellules blanches sont comptées sur 10 champs microscopiques de la couche monocellulaire du frottis où environ la moitié des cellules sont en contact et en prenant soin de ne pas inclure les thrombocytes qui peuvent ressembler aux petits lymphocytes (^{voir photo 2}). Le nombre de leucocytes total est ensuite obtenu en multipliant la moyenne de ces 10 champs de microscope par 2 000.

→ La méthode Unopette(r) ou Leukopette(r) (cela dépend de la société) est certainement la plus pratique et la plus employée dans les laboratoires vétérinaires. Elle utilise la phloxine B comme colorant. Le sang est dilué par un facteur 32 (25 µl dans 775 µl de phloxine) et laissé 10 minutes au contact du colorant. Une petite quantité est ensuite placée dans la chambre de comptage pendant 5 minutes pour que les cellules se stabilisent. Les cellules rouges réfringentes sont ensuite comptées (^{voir photo 3}) dans le grand carrécentral des 2 chambres de l’hémocytomètre en utilisant la “méthode du L”. Cependant, seuls les hétérophiles et les éosinophiles sont colorés par la phloxine, donc la formule leucocytaire est indispensable pour obtenir le nombre total de leucocytes. La formule suivante est utilisée (N est donné en nombre de cellules/µl) :

→ La technique de Natt et Herrick, décrite ci-dessus pour les érythrocytes, peut aussi être utilisée pour les leucocytes avec la même dilution et ne dépend pas de la formule leucocytaire. Avec cette coloration, les cellules blanches apparaissent en violet foncé et sont plus rondes que les cellules rouges (^{voir photo 4}). Sur une chambre de l’hémocytomètre, toutes les cellules sont comptées dans les 9 grands carrés (^{voir photo 1}). La formule suivante est ensuite employée (N en nombre de cellules/µl) :

→ La formule leucocytaire est déterminée au microscope selon des critères morphologiques et de coloration spécifiques (^{voir photo 5}). La morphologie des types cel­lulaires est aussi importante. Les hétérophiles toxiques ont un cytoplasme plus basophile, vacuolé, avec la présence occa­sionnelle de granulations anor­males ou de dégranulation. Les lymphocytes activés augmentent en taille et possèdent un cytoplasme plus basophile. Les lymphocytes sont généralement de plusieurs tailles chez les oiseaux. Certaines cellules se ressemblent et la différenciation entre 2 types cellulaires est parfois subtile, comme les gros lymphocytes avec les monocytes ou les petits lymphocytes avec les thrombocytes. Les parasites sanguins sont communs chez les rapaces (Hemoproteus spp., Plasmodium spp., Leucocytozoon spp.) et rarement pathogéniques, excepté chez certaines espèces nordiques ou dans certaines circonstances.