Prélever du lait pour rechercher Staphylococcus aureus

Les contraintes techniques de prélèvement, le coût et les délais nécessaires à l’identification des espèces bactériennes au laboratoire font que peu de diagnostics bactériologiques visant un agent pathogène mammaire sont réalisés en routine. Le schéma anglais de prophylaxie des mammites ne nécessite pas de telles analyses, et c’est là l’un de ses avantages (encadré 1).

Néanmoins, le contexte socio-économique évolue : paiement du lait à la qualité, risques pour la santé publique, utilisation raisonnée des antibiotiques. Dans certaines situations, un bénéfice économique peut être retiré du traitement en lactation des mammites subcliniques [15]. De plus, des vétérinaires praticiens souhaitent disposer d’éléments de décision objectifs [14]. Certains se forment alors au diagnostic bactériologique [11]. Davantage d’analyses bactériologiques pourraient donc être réalisées à l’avenir. Les principes généraux qui, de la collecte du lait de quartier à son exploitation au laboratoire, permettent le diagnostic méritent d’être rappelés, en particulier pour les mammites à Staphylococcus aureus (encadré 2) [2, 7].

Étape 1 : quand prélever et quel lait ?

Le diagnostic bactériologique est souvent de peu d’intérêt lors de mammite clinique car le traitement doit être débuté rapidement. Cependant, il permet de mettre en œuvre des mesures préventives adaptées en cas de flambée de mammites cliniques, c’est-à-dire un nombre important de cas dans un laps de temps relativement court, de l’ordre d’un à deux mois. Cette analyse détermine si l’agent pathogène en cause est sensible aux antibiotiques et, si oui, à quelles molécules, après des échecs thérapeutiques répétés dans un troupeau.

1. Aspects “choix raisonné du traitement”

En cas de mammites à S. aureus, un antibiogramme est réalisé. Parfois, la production d’une β-lactamase hydrolysant les pénicillines A et G est recherchée à l’aide du test céfinase [6, 16]. Ce dernier critère ne nous paraît pas être absolu pour préjuger de l’efficacité d’un traitement, et l’ancienneté de l’infection est le critère essentiel [1]. Le diagnostic précoce des mammites subcliniques à S. aureus et leur traitement en lactation sont économiquement justifiés dans certaines situations.

2. Aspects “sélection des animaux à prélever”

Lorsque des risques de non-commercialisation du lait ou de pénalités importantes existent, en raison de concentrations cellulaires élevées dans le lait de tank, l’identification des animaux infectés est requise. Des analyses bactériologiques concernant l’ensemble du troupeau ne sont pas envisageables en raison du coût. Différentes méthodes, déjà au point (concentrations cellulaires individuelles, milieux sélectifs, polymerase chain reaction ou PCR) ou en cours de développement (Élisa), permettent de présélectionner un nombre restreint d’animaux pour lesquels ces analyses bactériologiques classiques sont effectuées.

3. Limite de la bactériologie sur le lait de tank

Contrairement à ce qui est parfois avancé, le nombre de staphylocoques présents dans un lait de tank ne permet pas d’estimer de manière fiable le nombre de vaches infectées dans un troupeau. En effet, l’excrétion des bactéries dans le lait varie au cours du temps, il existe un facteur “dilution” important et le dénombrement comporte une part d’incertitude non négligeable (présence de “grappes”).

Bien que sans doute quantitativement peu importante, une origine extramammaire de contamination du lait de tank par S. aureus n’est pas à exclure, comme cela a été montré dans la filière caprine, par une méthode très discriminante de typage (variable number tandem repeat ou VNTR [5]).

La peau des mamelles ou les fosses nasales de l’éleveur figurent parmi les sources possibles [3].

Étape 2 : comment prélever ?

La mamelle est normalement stérile, et les infections mammaires sont dues à des agents pathogènes présents chez l’animal et/ou dans son environnement et qui pénètrent par le canal du trayon. Pour pouvoir considérer une espèce bactérienne comme responsable d’une infection, un prélèvement aseptique du lait de quartier doit être réalisé. Tout risque de contamination est si possible évité.

1. Méthode

L’extrémité du trayon est lavée et désinfectée soigneusement, soit avec de l’alcool à 70°, soit avec des lingettes imprégnées d’antiseptique, pour limiter les risques de contamination. Le récipient est stérile et possède une ouverture large. L’opérateur fait en sorte qu’aucune goutte de désinfectant ne tombe dans le flacon. Le prélèvement est effectué rapidement. Le trajet du lait entre l’extrémité du trayon et le flacon est le plus court possible ( et ). Le lait est extrait en pinçant l’extrémité si le trayon est court, en l’empoignant s’il est long. Tout contact entre la main et le lait est à éviter. Deux millilitres de lait, c’est-à-dire deux à quatre jets, suffisent pour l’exploitation au laboratoire. La méthode décrite n’est pas réservée aux seules infections staphylococciques.

2. Les premiers jets doivent-ils être éliminés ?

Selon certains auteurs, les premiers jets de lait collectés avant la traite seraient les plus riches en bactéries. Pour d’autres, les collecter présente le risque d’isoler des bactéries qui colonisent seulement le canal du trayon et ne sont pas responsables d’une infection intramammaire.

Selon notre expérience, ce risque est réel pour les prélèvements réalisés pendant le tarissement, lors du vêlage et dans les 48 heures qui suivent celui-ci.

En lactation, en dehors du péripartum immédiat, le premier jet est éliminé.

3. Un ou plusieurs prélèvements ?

Afin de diminuer le nombre d’échantillons faussement considérés comme stériles, deux prélèvements distincts successifs sont parfois recommandés. Cela augmente la probabilité d’isoler les bactéries lorsqu’elles sont peu nombreuses [9]. L’excrétion des S. aureus varie en effet considérablement au cours du temps. Elle est inversement proportionnelle à celle des polynucléaires neutrophiles (recrutés pour s’opposer à la multiplication des bactéries).

L’intérêt de la duplication du prélèvement est à rechercher dans l’évaluation du ratio coût/bénéfice de la procédure. Un seul prélèvement permet d’isoler la bactérie responsable dans 90 à 95 % des cas, un second dans 98 à 100 % des cas. Cependant, cela multiplie par deux le temps de travail et le coût de l’analyse. À coût égal, il est plus intéressant d’effectuer un second prélèvement différé dans le temps.

Les conditions d’exploitation de l’échantillon contribuent tout autant que le nombre de prélèvements à limiter les échantillons faussement négatifs.

Étape 3 : conservation et transport de l’échantillon

L’échantillon de lait collecté doit être placé immédiatement sous couvert du froid (4 °C), pour limiter la multiplication d’éventuels contaminants. Il peut être analysé jusqu’à 48 à 72 heures après la collecte.

La congélation à - 20 °C permet une conservation plus longue, et l’exploitation peut alors être différée de plusieurs mois. Contrairement aux entérobactéries, la viabilité des staphylocoques, dont la paroi est constituée d’un important peptidoglycane, est peu affectée par une congélation de plusieurs mois [13]. Dans les jours qui suivent la congélation, le nombre de staphylocoques exprimé par le nombre de colonies formant unités (UFC) paraît même augmenté : des forces de cisaillement provoquées par la congélation dissocient les “grappes” de staphylocoques. L’addition de 10 % de glycérol à l’échantillon de lait (à volume égal) permet une meilleure survie des bactéries après congélation, quelle que soit l’espèce [8]. Dans la mesure où l’échantillon est expédié congelé et qu’il parvient au laboratoire dans les 24 heures, le transport sous le régime du froid n’est pas indispensable.

Étape 4 : isolement et mise en culture

1.Choix du milieu

Pour l’isolement et la culture bactériens, un milieu solide, non sélectif, est requis. L’utilisation d’autres milieux, quels qu’ils soient, ne peut se faire qu’en parallèle, et non en remplacement. Seul un milieu non sélectif permet de juger de la qualité du prélèvement et d’interpréter le résultat de la culture.

La gélose Columbia au sang de mouton est le milieu de référence pour le diagnostic des mammites. Elle permet la croissance de presque tous les micro-organismes pouvant être responsables d’infections mammaires.

Elle donne des éléments d’orientation diagnostique d’après l’aspect des colonies et la présence éventuelle d’hémolyse(s).

2. Ensemencement

En raison de la répartition aléatoire des bactéries dans l’échantillon de lait et, parfois, de leur faible nombre, il convient :

- d’agiter vigoureusement le flacon (une partie des bactéries est “emprisonnée” dans la crème présente en surface) ;

- d’ensemencer la gélose avec un volume de lait aussi important que possible, soit entre 25 et 100 µl en pratique.

Au-dessous de 25 µl, le risque de culture faussement négative augmente.

L’ensemencement est réalisé selon la technique, classique en bactériologie, d’épuisement de la semence : des stries sont dessinées en quadrant, soit avec une anse, soit avec une pipette pasteur “boutonnée”, afin d’obtenir des colonies isolées.

3. Incubation

La boîte de Pétri est mise à incuber à 37 °C. Elle est placée à l’envers dans l’étuve pour éviter que l’eau de condensation ne tombe sur la gélose.

Quarante-huit heures peuvent être nécessaires. Cependant, pour les staphylocoques, une lecture après 16 heures d’incubation est possible.

4. “Erreur” des milieux sélectifs

Il existe des milieux sélectifs pour l’isolement de S. aureus. Leur composition a été définie pour inhiber la croissance de toutes les autres espèces bactériennes, ce qui n’est pas totalement effectif. Leur utilisation est justifiée pour un échantillon comportant une flore complexe, comme le lait de tank, pour déterminer la présence et le nombre de staphylocoques.

Un lait de quartier prélevé aseptiquement ne correspond pas à ce critère.

Employé seul pour un diagnostic de mammite, un milieu sélectif peut conduire à :

- impliquer faussement comme responsable d’une infection une espèce bactérienne qui est un contaminant ;

- obtenir un résultat faussement négatif, le milieu sélectif n’étant pas adapté à l’agent pathogène responsable de l’infection ou exerçant un effet inhibiteur sur un petit nombre de bactéries qui présentent des altérations physiologiques, donc fragilisées.

Le milieu sélectif ne peut ainsi être interprété qu’en fonction des résultats obtenus avec une gélose au sang. Son principal intérêt réside donc dans la possibilité d’identifier directement certaines espèces bactériennes, éventuellement sans tests additionnels, grâce à leur présence et/ou à la couleur des colonies (encadré 3).

Étape 5 : identification bactérienne

Sur une gélose au sang, les premiers critères d’interprétation sont :

- l’aspect, c’est-à-dire la forme et la couleur⁽¹⁾ ;

- le nombre de colonies différentes.

1. Difficulté diagnostique face à deux colonies

Si toutes les colonies ont un aspect identique, quel que soit leur nombre (seulement cincolonies peuvent être observées, par exemple), les bactéries isolées sont déclarées responsables de l’infection. Vouloir établir une relation entre le nombre de bactéries et la réalité et la sévérité d’une infection est une erreur scientifique.

La présence de deux types de colonies rend l’interprétation plus délicate : subjective, celle-ci demande une certaine expertise.

Le type et le nombre de colonies de chaque type doivent être pris en compte. L’association de deux espèces bactériennes dans les infections mammaires est relativement rare (moins de 10 % des cas). Elle n’existe pas lors de mammite clinique. Elle concerne le plus souvent des cocci à Gram+ (staphylocoques et streptocoques).

2. Limite des méthodes de biologie moléculaire

À côté des techniques classiques de bactériologie fondées sur des caractères phénotypiques, S. aureus peut être identifié directement à partir du lait par des méthodes d’amplification génique de type PCR. Comme pour l’utilisation des milieux sélectifs, la PCR est utile pour une recherche ciblée dans un milieu comportant une flore complexe.

Elle n’est pas justifiée pour un diagnostic de mammite à partir d’un lait de quartier car elle ne permet pas d’évaluer la qualité de l’échantillon. Il existe un risque important d’amplifier l’ADN de contaminants, ce qui conduit à une erreur de diagnostic et/ou à remettre en cause la notion de stérilité de la mamelle.

Ainsi, la décision de recourir à des analyses bactériologiques doit être fondée sur une estimation du rapport coût/bénéfice pour l’éleveur. Lorsqu’ils sont réalisés par le praticien, ces examens offrent des avantages : par exemple, le coût et les délais sont réduits, la communication avec l’éleveur est facilitée.

Les deux points les plus importants pour un diagnostic de mammite fiable exposés ci-dessus (prélèvement aseptique et milieu non sélectif) restent valables quel que soit l’agent pathogène en cause.

• (1) Voir la fiche “Identification de Staphylococcus aureus”, du même auteur dans ce numéro.